Proces simulatie en optimalisatie

Voor de optimalisatie van de individuele proces stappen maakt Bierverbetering.nl gebruik van een statistische methode genaamd ‘Design-of-Experiments’ (DoE). Het grote voordeel van DoE is dat je meerdere proces parameters tegelijk optimaliseert. Afhankelijk van de vraagstelling is DoE 10 tot 100x efficiënter dan traditionele proces ontwikkeling, wat zorgt voor kortere doorlooptijden voor proces optimalisatie en aanzienlijke besparingen in de ontwikkelingskosten van een nieuwe receptuur.

Proces simulatie van een DIPA – een voorbeeld uit de praktijk

Voor iedere DoE studie wordt het brouwproces geschaald (naar ~2L fermentaties), zodat meerdere bieren tegelijk kunnen worden gebrouwen, ieder met kleine variaties in proces parameters. De output wordt geanalyseerd met behulp van een statistisch model. Een voorbeeld van een DoE studie is een hop-utilisatiestudie, waarbij tevens is gekeken naar het effect van sucrose adjunct, naar het effect van schuim-stabilizatoren, en naar fermentatietemperatuur.

De resultaten van de studie zijnhieronder weergegeven. De product eigenschappen zijn gegeven in de 1e kolom, mogelijke oorzaken zijn gegeven in de 2e en 3e kolom. De gebruikte QC testen zijn gegeven in de 4e kolom, en de resultaten zijn weergegeven in de 5e kolom. Algemene en fysische-chemische (stabiliteits-) eigenschappen zijn bepaald na 6 week hergisting op fles.

De data zijn vervolgens geanalyseerd door middel van lineaire regressie. Het (eerste orde) lineaire model geeft aan welke quality modulators een significante bijdrage geven aan de ge-evalueerde kwaliteitsparameters (quality attributes)  De coëfficiënten geven aan hoe zwaar iedere quality modulator meeweegt in het statistische model. Wanneer een quality modulator een sterk effect positief effect heeft dan wordt dit in de tabel aangegeven met (++), een sterk negatief effect wordt aangegeven met (- -). Minder sterke effecten worden aangegeven met (+) en (-). Dus bijvoorbeeld voor pH heeft fermentatie temperatuur een sterk positief effect. De hoeveelheid whirlpool hop en dry hop hebben ook een positief effect op pH, maar minder sterk dan de temperatuur in de geteste ranges.

Troebelheid wordt bepaald door bitterhop en fermentatie temperatuur

Van de algemene eigenschappen wordt de troebelheid sterk bepaald (gemoduleerd) door de hoeveelheid bitterhop, die een negatief effect heeft. Anders gezegd, hoe meer bitterhop, hoe minder troebelheid. Dit is te verklaren uit de complexe interactie tussen polyfenolen en ‘Haze-Active’ (HA) eiwitten zoals beschreven in Siebert et al. (J. Agric. Food Chem., Vol. 47, No. 2, 1999). Polyfenolen vormen ‘bruggetjes’ tussen HA eiwitten, waardoor deze grotere complexen vormen die niet meer stabiel zijn in oplossing. Afhankelijk van de grootte kunnen deze complexen neerslaan (precipiteren), wat resulteert in minder troebel bier. De grootte van de complexen wordt bepaald door het aantal bruggetjes, dus hoe meer polyfenol, hoe meer precipitatie. Dus hoe meer polyfenol aanwezig is tijdens het koken, hoe minder HA eiwit er in het finale bier aanwezig zal zijn. Blijkbaar spelen extracten uit bitterhop – bijvoorbeeld xanthohumol of beta acids -hierbij ook een rol (zie ook https://escarpmentlabs.com/blogs/resources/dude-wheres-my-haze-advice-for-hazy-ipas).Het effect van de fermentatie temperatuur is minder sterk, maar een hogere fermentatie temperatuur geeft meer troebelheid. Mogelijk wordt dit veroorzaakt door sterkere cel groei bij hogere temperatuur, wat resulteert in meer gesuspendeerd gist na herfermentatie.

Restsuiker wordt bepaald door de sucrose adjunct

De hoeveelheid restsuiker wordt bepaald door de dichtheid (brekingsindex) te meten na 6 week herfermentatie op fles. De dichtheid is eveneens gemeten op het wort, voorafgaand aan de fermentatie, en na de fermentatie (dus van het jong bier). Zoals verwacht moduleert de hoeveelheid suiker adjunct de dichtheid van het wort, voor deze studie is de hoeveelheid mout immers hetzelfde voor alle bieren. Echter ook de eind-dichtheid van het jong bier en van het finale bier wordt gemoduleerd door de hoeveelheid suiker adjunct. Dit betekent dat de hoeveelheid restsuiker wordt gemoduleerd door de hoeveelheid adjunct, en niet door bijvoorbeeld fermentatietemperatuur of de hoeveelheid ‘bottle sugar’. Een interessante observatie is verder dat er in de smaaktesten een positieve correlatie wordt gevonden tussen de dichtheid van het wort, en de perceptie van zoetheid (R = 0.53, P=0.042, zie sectie smaakevaluaties). Dit suggereert dat de perceptie van zoetheid kan worden gemoduleerd met de hoeveelheid sucrose adjunct, dus voor een wat zoeter bier kun je beter wat meer sucrose toevoegen. Voor verdere discussie van het effect van de correlatie tussen dichtheden en smaak, zie de sectie ‘smaakevaluaties’. De dichtheid van het jong bier (de ‘FG’) laat verder een aantal interessante correlaties zien, namelijk met Tur I1, met conductiviteit (-), met schuimstabiliteit (+), en met A700 (+). Deze correlaties vertellen een intrigerend en opmerkelijk compleet verhaal op basis van 1 in-proces bepaling, namelijk dat FG wordt bepaald door celgroei: hoe sneller de celgroei hoe hoger de FG (getuige de positieve correlaties met A700 en Tur I1). Dit heeft negatieve gevolgen, bijvoorbeeld voor de schuimstabiliteit (zie onder), maar het geeft ook een hogere perceptie van fruitigheid (zie sectie smaakevaluaties).

Schuimstabiliteit wordt gemoduleerd door whirlpool hop en fermentatie temperatuur

Voor de schuim-stabiliteit test wordt op een gecontroleerde manier schuim gegeneerd met 100 mL bier. Vervolgens wordt de afname in schuim gemeten na 5 minuten. Hoe kleiner de afname, hoe stabieler de schuimkraag. De hoeveelheid whirlpool hop heeft een negatief effect op de afname: componenten uit de whirlpool hop stabiliseren dus de schuimkraag. De fermentatietemperatuur heeft een positief effect op de afname, oftewel een hogere fermentatietemperatuur geeft een minder stabiele schuimkraag. Interessant gegeven is dat de hoeveelheid bitterhop, bottle sugar en de hoeveelheid schuimverbeteraar geen significant effecten hebben op de stabiliteit van de schuimkraag binnen de geteste ranges. Schuimvorming in bier is het gevolg van een complexe interactie tussen eiwitten, hop resins en metaal-ionen. In het brouw proces wordt een groot deel van de in mout aanwezige eiwitten geprecipiteerd tijdens het koken, waarbij kleinere stabiele eiwitten en peptides opgelost blijven in het wort. Peptides worden tijdens de fermentatie opgenomen door het gist, maar de kleinere eiwitten (bijvoorbeeld LTP en protein Z) kunnen in het bier terecht komen ze een rol spelen bij de vorming van schuim. Humulonen komen voornamelijk uit de hop, die tijdens het koken worden omgezet in o.a. iso-α-zuur. Van α-zuur en iso-α-zuur (niet van β-zuren) is bekend dat ze tensio-aktief en foam positief zijn (Bamforth, C., J. Inst. Brew., November-December, 1985, Vol. 91, pp. 370-383). Chemische derivaten van iso-α-zuur (tetra, rho) worden dan ook vaak toegevoegd voor de stabilisatie van schuim in commerciële brouwerijen. De rol van metaalionen is complex, mogelijk spelen deze een rol bij de vorming van complexen tussen polyfenolen en eiwitten, waarbij ze de viscositeit en zo de stabiliteit van het schuim vergroten.

Bottle sugar heeft geen effect op de schuimstabiliteit, klaarblijkelijk wordt er in alle gevallen genoeg druk opgebouwd voor schuim vorming. De test is dan ook primair bedoeld om schuim-stabiliteit te meten, en deze hangt niet af van de hoeveelheid druk binnen de geteste ranges, maar van de hoeveelheid oppervlakte-actieve stoffen. Ook de schuimkraagverbeteraar had geen significant effect op de schuimstabiliteit, de chemische samenstelling hiervan is niet bekend (het gaat dus niet om schuimkraagverbeteraar op basis van polyfenolen).

Tot slot de temperatuur, deze heeft een negatief effect op de schuim-stabiliteit. Het mechanisme hiervoor is mogelijk een verlies van oppervlakte-actieve stoffen tijdens de fermentatie. Deze stoffen kunnen adsorberen aan hydrofobe oppervlaktes van de gistcel. Grotere celgroei zorg voor meer adsorptie en precipitatie van oppervlakte-actieve stoffen tijdens flocculatie van de gist. Dit effect is kleiner dan het positieve effect van de whirlpool hop, maar niet verwaarloosbaar.

Fysisch-chemische eigenschappen worden met name bepaald door hop addities en fermentatie temperatuur

Fysisch-chemische eigenschappen pH en conductiviteit zijn belangrijk voor de kwaliteitscontrole, met name ook voor de stabiliteit van het product. De belangrijkste factor voor de pH is de fermentatietemperatuur: hoe hoger de temperatuur, hoe hoger – minder zuur – de pH. Verder hebben de hoeveelheid whirlpool hop en dryhop een positieve correlatie met de pH, samen ongeveer evenveel als de temperatuur in de geteste ranges. Tijdens alcoholische fermentaties varieert de pH, waarbij deze in eerste instantie daalt door carbon-zuur productie (CO2), secretie van organische zuren, en door consumptie van bufferende stoffen (Gibson, B.R., FEMS Microbiol Rev 31 (2007) 535–569). Wanneer de ethanol concentratie toeneemt worden de celmembranen van gist permeabel, wat zorgt voor een influx van protonen en (dus) een toename van extracellulair pH (Dharmadhikari, M. Nitrogen metabolism during fermentation. Vineyard Vintage View 2001, 17, 5–7). Hoe groter de celmassa, hoe groter deze toename zal zijn. De positieve correlatie van pH en fermentatie temperatuur wordt mogelijk verklaard door een toename in biomassa bij hogere temperaturen, wat zorgt voor grotere resorptie van protonen en een stijging in pH (zie ook Webersinke, F, Journal of the American Society of Brewing Chemists, Volume 76, 2018 – Issue 3, waar een positieve correlatie wordt gerapporteerd tussen celmassa en pH stijging). Conductiviteit is eveneens positief gecorreleerd met de hoeveelheid whirlpool hop, dry-hop, en fermentatietemperatuur evenals de pH. Verder is er een kleine maar significante negatieve correlatie met de hoeveelheid sucrose adjunct, dus hoe meer sucrose, hoe lager de conductiviteit. Dit is mogelijk een direct gevolg van het effect van ethanol op conductiviteit van het wort – ethanol heeft zorgt voor lagere conductiviteit van waterige oplossingen. Een interessante observatie is dat er in smaaktesten (zie sectie smaak evaluatie) een negatieve correlatie wordt gevonden tussen pH van het bier, en de perceptie van zure afdronk (R = -0.54, P=0.039). De zure afdronk is op zijn beurt weer gecorreleerd met de hoeveelheid bitterhop en de IBUs. De conductiviteit is gecorreleerd met de pH (R=0.67, P= 0.0058), maar heeft geen significante correlatie met de zure afdronk (R= -0.40,P = 0.137). Echter de conductiviteit heeft wel een negatieve correlatie met de perceptie van zoete smaak (R= -0.46, P=0.085), en met meerdere proces parameters die zijn gerelateerd aan de hoeveelheid sucrose adjunct. Dit alles onderstreept het belang van QC testen, voor de kwaliteitscontrole, maar zelfs om mogelijke smaakdeviaties voortijdig te signaleren.

Iso-α-zuur (IBU) wordt gemoduleerd door bitterhop

De IBU zoals bepaald met een spectrofotometrische bepaling na extractie met iso-octanol heeft een positieve correlatie met de hoeveelheid bitterhop. Geen significantie correlaties zijn gevonden met de whirlpoolhop en de dryhop, de temperatuur tijdens de hopstand en de fermentatie is te laag voor isomerisatie van α-zuren. Interessant gegeven is hier dus ook dat de IBU niet correleert met de perceptie van bitterheid, maar wel met de perceptie van zuurheid in de afdronk (R=0.57, P = 0.0255, zie sectie smaak-laboratorium).

Celgroei geeft meer fruitigheid, maar minder kruidigheid

Tot slot de IPCs – t1 (lag time) en I1 (intensiteit) van de massa en van de turbiditeit zoals beschreven in de sectie ‘kwaliteit op maat’. Onderling zijn t1 van de massa en de turbiditeit sterk gecorreleerd, de massa-afname volgt snel na de toename in turbiditeit (voor turbiditeit en troebelheid geldt een inverse relatie, dus een diep dat betekent een toename in turbiditeit). Dit is consistent met het idee dat de turbiditeit in eerste instantie sterk wordt bepaald door celgroei, en de massa afname door alcoholische fermentatie. De fermentatie temperatuur correleert zoals verwacht sterk met de I1 waardes, dus de snelheid van snelgroei en de snelheid van fermentatie. De I1 van de turbiditeit heeft een lichte negatieve correlatie met de hoeveelheid bitterhop, mogelijk dat α-zuren de groei licht remmen. Van iso-α-zuren is dit aangetoond (Hazelwood, L.A. et al, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Jan. 2010, p. 318–328). Interessant gegeven hier is dat een aantal van de IPCs correleert met de secondaire smaakparameters ‘Kruidigheid’ en ‘Fruitigheid’ (zie sectie Smaak-evaluaties). Er is een mogelijke positieve correlatie tussen I1 van de turbiditeit (dus de snelheid van snelgroei) en de fruitigheid (R=0.45, P = 0.096), en een negatieve correlatie tussen de I1 van de turbiditeit en de kruidigheid (R = -0.53, P= 0.040). Ook de I1 van de massa correleert mogelijk negatief met de kruidigheid (R = -0.45, P = 0.090). Het verlies van kruidigheid met een meer intense celgroei en fermentatie is gemakkelijk te verklaren door het verlies aan hydrofobe verbindingen door grotere celmassa en meer adsorptie van hydrofobe terpenen en terpenoiden. (Rettberg, N. et al (2018), Journal of the American Society of Brewing Chemists, 76:1, 1-20). De hogere perceptie van fruitigheid bij hogere fermentatie temperatuur komt mogelijk door betere biotransformatie tijdens de fermentatie, wat resulteert in fruitige aroma’s.

Samengevat illustreert het belang van testen als conductiviteit, pH, A700, dichtheid en IPCs, en van kwaliteitscontrole in het algemeen. Deviaties in resultaten van dergelijke testen kunnen duiden op variaties in grondstof (hops), op proces deviaties, of op problemen met het gist metabolisme. Door de proces simulatie is meteen helder welke parameters effect hebben op de verschillende product eigenschappen, bijvoorbeeld fermentatie temperatuur die een sterk effect heeft op celgroei en fermentatie, en een aantal gerelateerde parameters zoals schuimstabiliteit, pH en troebelheid tgv gesuspendeerd gist. Troebelheid kan bijvoorbeeld worden gereduceerd door de hoeveelheid bitterhop te verhogen, terwijl een ‘hopstand’ een positief effect heeft op de schuim-stabiliteit. Dry-hop daarentegen heeft wat minder effect op celgroei, fermentatie, of schuimstabiliteit, maar wel op fysisch-chemische parameters die mogelijk van belangrijk zijn voor stabiliteit van het bier. Tot slot is het goed om te weten dat fermentatietemperatuur gecorreleerd is met celgroei en fermentatiesnelheid, en dat dit kan leiden tot smaakverlies – verlies van kruidigheid – in je bier.